Elektroforez nedir?

ELEKTROFOREZ
Belirli bir pH’da ve belirli bir elektrik alanında yüklü taneciklerin farklı hızlarda yürüyerek ayrılmaları tekniğine elektroforez denir.
 Elektrik akımı
 Ayrılacak moleküllerin yüklü olmasıdır.
Elektroforez yönteminde ortamın pH’ı; tampon çözelti ile, elektrik alanı ise doğru akım veren bir güç kaynağından sağlanır.
Her bir taneciğin elektriksel hareketi farklı olduğundan birbirinden ayrılabilirler.
M: Elektriksel hareketlilik (Cm2/Volt.sn)
V:Göç hızı


E: Elektriksel alan şiddeti
Örneğin; Na+ ve C1- için M değeri 4.10-4- 3. 10-4 cm2/volt.sn arasındadır. Nükleik asitler için 0,1.10-4 - 1.10-4 cm2/volt.sn arasındadır.
Elektroforezde ayırım; kütle ile ters, yükle doğru orantılı olduğundan, proteinlerin de kütle ve yükleri farklı olduğundan bu yöntemle ayrılabilirler.
Elektroforez çeşitleri
1. Kağıt elektroforezi
2. Yüksek gerilimli kağıt elektroforezi
3. Selüloz asetat elektroforezi: Klinik amaçla kullanılır.
4. Nişasta elektroforezi : süt proteinlerinin ayrılmasında kullanılır.
5. poliakril amid jel elektroforezi (PAGE): Proteinlerin ayrılmasında kullanılır.
6. Poliakril amid jel elektroforezi üç farklı şekilde hazırlanabilir.







Slab Jel : iki tabaka arsında oluşturulan jeldir.
Disk Jel: tüplerde yapılan jeldir.
Tabi şartlar: şartlar öyle ayarlanmalıdır ki; protein tabii halini muhafaza etmezsi gerekir bu şartlarda elektroforez soğukta yağılır ve denatüre edici bütün şartlardan korunur bu elektroforezde izoenzim çalışmaları yapılır. Bir izoenzimle çalışıldığında, proteinler ayrıldıktan sonra jel, enzime spesifik substrat çözeltisine daldırılır ve enzim olan yerler renklenerek bant oluşturur.
Denatüre edici şartlar: Ortama SDS ilave ederek ve aynı zamanda b-merkapta etanol ile bisülfit bağları parçalanarak protein denatüre edilir. Ayırım; yük esasına göre değil, molekül büyüklüğüne göre olur. Çünkü SDS, her üç peptid bağına karşılık, bir SDS molekülü bağlanacak şekilde ortamda bulunduğundan, proteinler tamamen SDS yükü ile yüklenmiş olurlar. Dolayısıyla yük farkı ortadan kalkmış olur. Proteinin ne derece saflaştığını anlamak için SDS-PAGE elektroforezi uygulanır.
Kesiksiz jel : bütün jel boyunca akrilamid konsantrasyonu sabittir.
Kesikli jel : jelin üst kısmına yığma jeli, alt kısmına ayırma jeli denir.

%10 %3
akrilamid
%2
Kesiksiz jel Kesikli jel

%3 akrilamid konsantrasyonu olduğunda parlar daha büyüktür. Proteinler daha hızlı yürürler ve ayırma jeline gelince yığılırlar ve daha sonra beraber yürürler.Bu yüzden kesikli jel daha avantajlıdır, bantlar daha nettir.
Jelde proteinler yürütüldükten sonra, yerlerini belirlemek üzere; Coomassie brillant blue R-250 veya Coomassie brillant blue G-250 ihtiva eden bir çözelti içinde bir bucuk saat kadar karıştırılır. Bu sırada hem protein (CH3 COOH, CH3 OH ve H2O) uzun süre çalkalanır. Bu esnada zeminin rengi açılarak protein olan yerler bantlar oluşturur.

PROTEİN SAFLAŞTIRMA ŞEMASI
Bir protein ve enzim saflaştırılırken; farklı saflaştırma basamağı uygulanırsa her bir basamakta elde edilen çözeltiden 1-2 mL saklanarak, daha sonra her saflaştırma basamağı için ; enzim aktivite miktarı ve protein miktarı ölçülür. Daha sonra tablo hazırlanarak; % verim ve spesifik aktivite hesaplanarak, saflaştırmanın kaç kat olduğu hesaplanır.




Afinite Kromde Sığır Eritrositlerinden CA’nın Saflaştırılması

Fraksiyon Hacim(mL) Afinite E.U. Toplam aktivite Protein Spesifik aktivite Saflaştırma
(A kat)
Hemolizat 50 0,749 50.0,749=37,45
%100 143,8 _

Afinite Krom 50 0,608 0,286



Saflaştırılan enzimler, yüksek konsantrasyonlarda (10 mg/mL) derin dondurucuda bekletilerek muhafaza edilir. Enzim değişik değilse, ortama serum albumin ilave edilerek derişikleştirilir. Bazen ortalama %50 gliserin veya dimetil sülfoksil katılarak enzim muhafaza edilir. Bazı enzimlerde ise doygun A.S. çözeltisinde daha iyi muhafaza edilir.
Enzim saflaştırmanın monoton bir kuralı yoktur. Uygun lipant bulunursa, afinite krom yapılmalıdır. Yoksa aşağıdaki basamaklar veya sıra takip edilir;
1) Kısmı saflaştırılma metotlarından birisi uygulanır. A.S. çöktürmesi, organik çözümlerle çöktürme veya sıcaklık çöktürmesi kullanılır.
2) Jel filtrasyon kromatografisi, iyon değişim krom, anorganik jel adsorpsiyonu metotlarından biri veya bir kaçı yapılmalıdır.
3) Elektoforez yapılır; tabii elektroforez, izoelektrik fokuslama yapılır.
İzoelektrik fokuslamadan önce, polikatyonik amin kullanılarak pH gradenti oluşturulur. Protein çözeltisi tatbik edilir ve yürütülür. Her protein kendi izoelektrik pH noktasına geldiğinde yüksüzleşir ve elektrik alanda göç eder.
ENZİM SAFLIĞININ ÖLÇÜLERİ
1) SDS- PAGE jel elektroforezi yapılarak, sonuçta tek bandın oluşması, enzimin saf olduğunun işaretidir. Ancak bazı enzimler mol ağırlığı faklı olan alt birim ihtiva ederler. Bu durumda enzim saflaştığı halde birden fazla bant ortaya çıkabilir, bu durum aldatıcı olabilir. Bu durumlarda tabii şartlarda elektroforez yapılarak enzimin saflığı anlaşılır.
2) Enzim saflığının ikinci ölçüsü spesifik aktivitedir.
Spesifik Aktivite =
Yeni bir saflaştırma basamağı uygulandığında spesifik aktivite değişmiyorsa enzim saftır denir.
ENZİM AKTİVİTESİ TAYİNİ

V- [S] grafiğinde görüldüğü gibi [S] konsantrasyonu arttırdığında hızda artar. Belli bir hızdan sonra enzimin aktif bölgeleri substratla tamamen doldurulduğu için substrat konsantrasyonu arttırdığı halde hız değişmez. Bu noktadaki hıza Vmax denir. Maksimum hızın yanına geldiği andaki substrat konsantrasyonuna ise KM denir.
Vmax’dan itibaren hız, enzime bağlıdır, substrat konsantrasyonuna bağlı değildir. Bir ortamdaki enzim miktarı, enzim aktivite miktarı ile bulunur. Bir biyolojik materyaldeki enzim miktarı mg olarak verilmez. Çünkü ortamda bir çok safsız protein vardır. Bunun için enzimlerin katalizlediği spesifik reaksiyonlardan çıkarak, biyolojik materyaldeki enzim miktarı, enzim ünitesi (E.U.) olarak verilir.
Enzim ünitesi (E.U.): 250 C de optimal şartlarda (en uygun pH, iyonik şiddet, sıcaklık) bir dakikada/mal substrat ürüne dönüştüren enzim miktarına enzim ünitesi (E.U.) denir.
Katal: Optimal şartlarda 1 sn’de, 1 mol substrat ürüne dönüştüren enzim miktarıdır.
Enzim aktivite tayini için şu bilgilere ihtiyaç vardır;
- Katalizlenen reaksiyonun net denklemi.
- Enzimin katalizör veya metal iyonuna ihtiyaç olup olmadığına.
- Substrat KM değeri.
- Optimum şartlar.
- Birim zamanda, substratın kaybolma ve ürünün oluşma miktarını veren analitik bir metot.
Substrat konsantrasyonu= 100 x KM olursa doygun olur.
AKTİVİTE ÖLÇÜM METOTLARI
1) Spektrofotometrik Metot: Substrat, ürün veya bunların türevi belirli bir dalga boyunda ışığı absorbe eder. Absorbans ölçümü ile madde miktarına geçilebilir.
A= €. b.c. (Beer-Lambert eşitliği)
A: Absorbans
€: Molar ekstraksiyon
b: Işık uzunluğu (cm)
c: Konsantrasyon(Mol/L)
Her madde için € sabit, b işaretinden dolayı sabittir. Dolayısıyla abosrbans madde konstrasyonuna (c) bağlıdır.
a. Direkt Spektrofotometrik Metot
Enzimatik bir reaksiyonda, substrat ve ürünlerden birinin belirli bir dalga boyunda ışığı absorblaması esasına dayanır.

Bundan NADH 340 ve 365 nm dalga boyunda ışığı absorbe eder. Bundan faydalanarak LDH’ın aktivite tayini için aktivite ölçüm ortamına, optimumum şartları sağlayacak şekilde piruvat, NADH ve tampon çözelti konarak başlangıçtaki NADH miktarı söz konusu dalga boylarında absorbansı ölçülerek belirler. Daha sonra ortama LDH’li numune konulur. Numune belirli bir süre inkübe edilir. Bu süre sonunda ortamda kalan NADH miktarı bulunur. Başlangıçtaki NAHD miktarından son durumdaki miktarı çıkarılarak NADH miktarı bulunur.
Örnek: Başlangıçta 100 M mol olan NADH 5 dakika inkübe ediliyor. Bir süre sonra NADH miktarı 10 M mol olarak ölçülmüştür. Buna göre enzimin E.U’sunu ve kaç katal olduğunu bulunuz?
∩NADH =100 – 10 = 90 µ mol
E.U.=90/5 = 18 µ mol/dak
18 E.U.= 18.60
= 1080 µ katal
= 1080.10-6 katal
= 1,08. 10-3 katal.
b. İndirect Spektrofotometrik Metot
Bu metotta enzimin katalizlediği reaksiyonun substrat veya ürünleri değil, bağlı bir reaksiyonun substrat veya ürünlerinin birim zamanda harcanma veya oluşma ürünleri spektrofotometrik olarak ölçülebilir. Ancak bağlı reaksiyonun hızı, normal reaksiyonun 100-1000 katı olmalıdır.
Glutamat
Okzal asetat
transaminaz
keto glutarat + Aspartat Glutamat + Okzal asetat
(GOT)
malat dehidrogenaz
okzal asetat + NADH + H+ Malat + NAD+
İkinci reaksiyondaki NADH miktarını ve dolayısıyla okzal asetat miktarını buluruz. Okzal asetat da, birinci reaksiyondan meydana gelir.
GOT enziminin aktivite ölçümünde: optimum şartları sağlayacak şekilde tampon, x-keto glutarat, aspartat, NADH, malat dehidrogenaz ve en son olarak GOT ihtiva eden numune konur, belirli süre sonucunda 340 veya 365’nm de absorbans ölçümüyle NADH’daki azalma bulunur. Bu azalma, aspartattaki azalmaya karşılık gelir. Buradan aktiviteye geçilir.
c. Renkli türev oluşumu
Bir enzimatik reaksiyonun, substrat veya ürünü spesifik bir absorbans vermesine karşılık, bunların herhangi birinin renkli türevi oluşturulup absorbansı ölçülerek aktivite ölçümüne geçilebilir.



Örnek:
Glukoz – 6 - fosfataz
Glukoz – 6 – fosfat + H2O Glukoz + H2PO4- fosfamolibdik asit





Molibdenum mavisinin absorbansına bakılarak diğer ürünlerin miktarı bulunur. Böyle bir reaksiyon için reaksiyon durdurulmalıdır. Bu da ya inhibitörle veya proteinleri çöktürmekle elde edilir.
2. Titrimetrik Metot
Bu metotta, enzimatik reaksiyonla asit veya baz oluşur. Asidi bazla, bazı asitle uygun bir indikatör yardımıyla titre ederek harcanan substrat miktarı bulunur.
CA X VA = CB X VB
Üreaz
Üre + H2O 2 NH3 + CO2 (NH3 miktarı indikatör yardımıyla HCl ile titre edilir)

3. Fluorometik Metot
Substrat veya ürünlerden birisi floresans karakterde ise; birim zamanda harcanma veya oluşma miktarı fluorometrik olarak ölçülüp, aktiviteye geçilir.
4. Polarimetrik Metot
Asimetrik C atomu bulunduran bileşikler, polarize ışığı sağa veya sola çevirirler. Bu çevirme açısı konsantrasyonla doğru orantılıdır. Polarize ışık aynı düzlem üzerindeki ışıktır.

: spesifik çevirme açısı
: polarimetri cihazının ölçtüğü çevirme açısı
l: Işık yolunun uzunluğu
c: Konsantrasyon
Enzimatik bir reaksiyonda substrat veya ürün optikçe aktiftir. Birim zamanda harcanma veya oluşma miktarı polarimetik olarak takip edilebilir.


H  C = O triaz – fosfat izomeraz CH2OH
׀ ׀
H  C OH C = o
׀ ׀
CH2OPO3-2 CH2OPO3-2

Gliseraldehit – 3 – fosfat’ın yapısında asimetrik C atomu bulunduğu için polarimetrik olarak ölçülebilir.
5. Kalorimetrik Metot
Enzimatik reaksiyonların bir çoğu dışarı ısı veren reaksiyonlardır. Dışarı çıkan ısı ile harcanan substrat arasında bir bağlantı vardır. Isı ölçümü ile aktivite ölçümüne gelir.
6. Radyoaktivite Metodu
Bu metot daha çok DNA ve RNA polimeraz enzimlerinin aktivite ölçümlerinde kullanılır. Bunun için genellikle 32p ile işaretlenmiş substratlar kullanılır. Radyoaktivite ölçümüyle aktivite ölçümüne geçilir.
DNA polimeraz
(DNA)n + dNT 32P (DNA) n+1 PPi
deoksiribo
nükleosit
trifosfat

7. Viskozimetrik Metot
Bu metot daha çok DNA az enziminin aktivite ölçümünde kullanılır. DNA az enzimi DNA’yı parçaladığı zaman, viskozluk azalır. Viskozluğun ölçümüyle aktivite ölçümüne geçilir.
8. Condüctimetrik Metot
Bir enzimatik reaksiyonda iyon harcanabilir veya oluşabilir. İletkenlik ölçülerek aktivite hesaplanabilir.
9. Manometrik Metot
Bir enzimatik reaksiyonda bir gaz oluşur veya harcanabilir. Gazın manometrik ölçümüyle aktivite tayin eder.
Enzim Aktivite Ölçümünde Dikkat Edilecek Kurallar :
- Kinetik çalışmalarda sürekli aynı enzim çözeltisi kullanılmalıdır.
- Aktivite ölçümünde, enzim miktarı fazla ise substrat kısa zamanda tükenir ve hassas sonuç alınmaz. Bu yüzden enzim seyreltilmelidir.
- Bazen belirli süre sonunda reaksiyonun durdurulması gerekir, bunun için ortama TGA veya inhibitör katılır.
- Bazen reaksiyon birinci dereceden olmayabilir. Bu durumda başlangıç hızı esas alınmalıdır.
- Optimum pH ve sıcaklıkta çalışılmalıdır. Uygun tampon buna göre seçilmelidir.
- Bazen substrat, belirli bir konsantrasyondan sonra inhibisyon etkisi gösterebilir, bu durumdan kaçınılmalıdır.
V


Vmax Bu noktadan sonra daha fazla substrat
alınmamalıdır.


[S]
- Tampon reaksiyona girmemelidir.